發布日期：2022-05-06 15:17:52
Single-cell landscape of immunological responses in patients with COVID-19
2020年7月，Nature Immunology 發表了關于新冠病人免疫反應的單細胞全景圖譜研究，該研究利用10X單細胞轉錄組測序+單細胞TCR&BCR免疫組庫測序技術，對5個健康人和13和新冠患者的PBMC樣本測序分析。通過確定免疫細胞的轉錄譜，結合組裝好的T細胞受體和B細胞受體序列，分析免疫細胞的功能特性。COVID-19患者的大多數細胞類型顯示出強烈的干擾素-α反應和整體急性炎癥反應。此外，高細胞毒性效應T細胞亞群的密集擴張，如CD4+效應因子-gnly 、CD8+效應因子-gnly和NKT CD160，與中度患者的康復相關。在重癥患者中，免疫系統的特點是干擾素反應紊亂，嚴重的免疫衰竭，扭曲的T細胞受體庫和廣泛的T細胞擴張。這些發現提示了疾病進展過程中免疫反應的動態性質。
一. 研究背景及意義
在新冠肺炎中，疾病嚴重程度與宿主免疫應答之間的關系尚不完全清楚。研究描繪了在COVID-19疾病進展過程中血液免疫細胞的高分辨率轉錄情況，這將有助于更好地理解疾病的保護性和致病性免疫反應。
二. 樣本
5個健康人、13個患者(中度7,重度4和恢復期6，有4個與中度的配對），PBMC
三. 技術
10X單細胞轉錄組測序+單細胞TCR&BCR免疫組庫測序
四.結論
1.外周血免疫細胞的單細胞表達譜概述
繪制了122,542 個單細胞聚類圖，14個細胞類型及各類型的marker基因的在整體中的表達情況。明確了外周血細胞的組成。
2.不同疾病狀態下細胞組成的差異
2.1 為了揭示中度、重度和恢復期新冠肺炎患者與健康人相比細胞組成的差異，該研究對每個樣本的14個細胞類型的相對比例進行計算。在中度患者中，活化的T細胞群的相對百分比達到峰值，即使在恢復期也沒有恢復到正常水平；幼稚T細胞、MAIT細胞和mono DCs的相對豐度隨著疾病的嚴重程度而下降，這些群體后來在恢復期患者中恢復。
2.2 接下來，為了研究COVID-19感染期間的抗病毒和病原性免疫應答，該團隊評估了兩個重要通路的表達水平。發現兩條GO通路在疾病中顯著高表達：干擾素(IFN)-α反應與急性炎癥反應。在COVID-19患者的pbmc中，IFN-α的應答在所有主要細胞類型中均一致且顯著上調，在重癥患者中幾乎所有主要細胞類型的應答均最高（除血漿B細胞在中度患者的IFN-α反應最大外）。幾種細胞類型在急性炎癥反應中表現出大致與疾病嚴重程度相對應的趨勢，包括活化T細胞、γδ T細胞、NK細胞和CD16+單核細胞。
這些結果表明COVID-19患者存在強烈的整體促炎癥反應。
3.在天然免疫細胞中觀察到強烈的干擾素反應
進一步研究感染COVID-19之后的先天免疫細胞的轉錄組學變化，該團隊比較了CD14+和CD16+單核細胞在中度/重度與健康狀態下的表達達情況。發現顯著差異表達的基因參與了COVID-19患者的IFN反應、髓樣白細胞激活、細胞因子產生和NF-κB信號通路。
這些結果表明，COVID-19患者的大多數先天免疫細胞類型顯示出強烈的IFN反應。
4.COVID-19患者T細胞亞群表達特點
4.1 為了探究四種情況下個體間T細胞亞群的變化，研究者將PBMCs中的T細胞進一步分群，根據經典T細胞標記物的表達和分布共獲得了12個亞群：包括CD4+ T細胞(CD3E+CD4+)的6種亞型、CD8+ T細胞的3種亞型(CD3E+CD8A+)和3種NKT細胞亞型(CD3E + CD4-CD8A-TYROBP +)。
4.2 在CD4+ T細胞的6個亞型中，除了naive CD4+ (CD4+ naive) T 細胞(CCR7+SELL+), memory CD4+ (CD4+ memory) T 細胞(S100A4+GPR183+), effector memory CD4+ (CD4+ effector memory) T 細胞 (S100A4+GPR183+GZMA+) 和 regulatory T (Treg) cell (FOXP3+IL2RA+) 亞型，該研究還定義了兩種新的CD4+效應T細胞亞型：CD4+ effector-GZMK and CD4+ effector-GNLY，后者高表達細胞毒性相關基因如NKG7, GZMA, GZMB, GZMH 和GNLY，而前者高表達GZMK基因且低表達其他細胞毒性相關基因。
4.3 為了深入了解T細胞亞群的特征，研究者評估了在四種情況下每個亞群的分布情況。值得注意的是，與HDs相比，COVID-19患者中CD4+ naive、CD4+ memory、CD4+ effec- tor memory、Treg、CD8+ naive和NKT naive等naive狀態T細胞亞群比例下降。即使在恢復期，CD4+初發、CD8+初發和Treg的比例也沒有恢復到HDs的水平。相比之下，COVID-19患者中活動狀態T細胞亞群(包括CD4+效應- gnly、CD8+效應- gnly、NKT CD56和NKT CD160亞群)的比例增加，即使在conv患者中，這些細胞毒性亞群的比例也很高。特別值得注意的是，CD4+ effector-GNLY亞群在HDs中幾乎不存在，但在中、重度和conv患者中高度富集。此外，與中度患者相比，重度患者NKT CD160亞群的豐度明顯降低。
4.4 然后，研究者評估了四種條件下不同效應態T細胞亞群的細胞毒性和衰竭評分。CD4+ effector-GNLY、CD8+ effector-GNLY、NKT CD56和NKT CD160亞群的細胞毒性評分高于其他亞群。在這些具有高度細胞毒性的亞群中，除了CD4+ effector-GNLY亞群外，HDs的細胞毒性評分最低，而中等水平的情況顯示出最高的細胞毒性狀態。CD4+ effector-GZMK、CD8+ effector-GZMK和NKT CD160組較其他亞群表現出更高的衰竭評分。在這些高度衰竭的亞群中，HDs都有最低的衰竭得分，而重度患者表現出最衰竭的狀態。
4.5 為了進一步研究COVID-19感染后T細胞轉錄組的差異變化，研究者比較了效應T細胞(不包括CD4+ naive、CD4+ memory、CD8+ naive和NKT naive亞群)在中度、重度和HD患者中的表達譜。 發現COVID-19患者中表達上調的差異基因參與了包括IFN，細胞因子的產生，細胞殺傷，白細胞細胞粘附和細胞骨架組織等在內的過程。此外，使用凋亡和遷移評分系統，觀察到嚴重患者的T細胞可能經歷了遷移和凋亡。重癥患者PBMC中細胞死亡和遷移途徑的顯著激活提示，細胞死亡和淋巴細胞遷移可能與淋巴細胞減少有關，這是重癥COVID-19患者常見的現象。
5.在COVID-19患者中T細胞的克隆擴增和V(D)J基因的首選使用
5.1 接下來，為了深入了解單個T細胞之間的克隆關系和V(D)J基因在四種情況下的使用情況，研究者從TCR測序中重建了TCR序列。簡單地說，除三個NKT亞群外，所有亞群中有超過70%的細胞具有匹配的TCR信息。首先，與HDs相比，克隆擴增在COVID-19患者和恢復期患者中表現明顯；克隆擴增在中度和恢復期的程度高于重度期，同時，在嚴重的情況下，沒有大量的克隆擴增(克隆大小>100)，提示重癥患者可能缺乏有效的效應T細胞克隆擴增。研究者觀察到T細胞亞群之間有不同程度的克隆擴增。
5.2 為了研究COVID-19和HDs患者TCRs的動態和基因偏好，我們比較了四種情況下V(D)J基因的使用情況。前10位CDR3序列在4種條件下均有差異。值得注意的是，研究者發現了V(D)J基因在COVID-19患者中的不同用法，多樣性降低，尤其是在TRA基因中更為明顯。研究者還發現與中度和恢復期患者相比，重度患者中TRAJ39和TRAJ43的表達較高。重度患者首選TRBJ基因為TRBJ1-1，而中度和非重度患者首選TRBJ2-1。V(D)J基因的選擇性使用表明，不同的免疫優勢表位可能驅動T細胞反應的分子組成，并可能與SARS-CoV- 2特異性感染有關。
6. COVID-19患者B細胞亞群特征
為了追蹤不同B細胞亞型的動態變化，研究者根據典型B細胞標記物的表達和分布將B細胞分為6個亞群：一個naive B亞群集(MS4A1+IGHD+)，一個memory B亞群(MS4A1+CD27+)，一個intermediate memory B 亞群(IGHD+CD27+ ），1個germinal center B 亞群(MS4A1+NEIL1+)和2個plasma亞群：plasma B (MZB1+CD38+)和dividing plasma B (MZB1+ CD38+MKI67+) 。值得注意的是，COVID-19患者活躍狀態B亞群(包括生發中心B、血漿B和血漿B分裂亞群)的比例比HDs患者增加。與HDs相比，COVID-19患者的記憶B細胞比例下降。
為了進一步研究SARS-CoV-2感染后B細胞轉錄組的差異變化，我們比較了中重度和HD患者B/漿細胞的表達譜。COVID-19患者中最顯著富集的差異基因涉及與IFN反應相關的基因。此外，在重癥患者中，差異基因與蛋白質合成、粘合和運輸相關的生物過程相關。這些結果揭示了COVID-19患者B細胞亞群的轉錄組特征。
7.重癥患者B細胞擴張與V(D)J基因特異性重排
研究者從BCR測序中重建了BCR序列，并分析了BCR克隆擴增的狀態。簡單地說，BCRs在每個集群中的檢出率都在75%以上。還發現，與其他三種情況相比，重癥患者的B細胞表現出明顯的克隆性擴增，說明重癥患者的B細胞活性和體液免疫應答被強烈激活。這讓人想起其他研究者以前的觀察結果，較高的抗體滴度與較差的臨床結果相關。這引起了人們的關注，病原體導向的抗體可以促進疾病病理，導致類似于SARS觀察到的抗體依賴增強。
接下來，研究者分別評估了在中度、重度和恢復期疾病患者中IgA、IgD、IgG和IgM (IgE未檢測)的分布情況。在大多數患者中，IgM是主要的免疫球蛋白。與HDs相比，COVID-19患者的IgG含量增加，而IgM含量減少。在恢復期患者中，IgG和IgM水平恢復到與HDs相似的水平。
為了研究BCR的偏V(D)J重排，我們在四種條件下比較了V(D)J基因的使用情況。與其他三種情況相比，我們發現在嚴重情況下B細胞的V(D)J使用更有特異性，這表明在嚴重情況下B細胞可能經歷了獨特和特異性的V(D)J重排。還發現，IGHJ4在所有HDs和患者中都得到了廣泛的應用，但與其他三種情況下的患者相比，IGHJ4的配對IGHV基因在重癥患者中是不同的。還觀察到重度患者中IGHV3-7的過度表達。此外，在重癥患者中V-J頻率最高的兩對分別是IGHV3-7/IGHJ4和IGKV3-15/IGKJ3。綜上所述，重癥患者的B細胞克隆增加和IGHV和IGKJ基因的濫用提示SARS-CoV-2感染與宿主B細胞中的V(D)J重排有關。值得注意的是，在重癥患者中選擇性使用顯性IGV基因，特別是IGHV3-7和IGKV3-15，可能有助于疫苗的設計。
五. 總結
綜上所述，本研究中對SARS-CoV-2感染的復雜動態免疫反應的綜合多細胞描述奠定了基礎。這些數據，加上詳細的基于TCR和bcr的血統信息，可以為深入了解COVID-19患者外周血淋巴細胞提供豐富的資源，為合理設計治療方案和開發sars - cov -2特異性疫苗鋪平道路。